FISIOLOGI TERAPAN
Pengaruh menggabungkan detoxified bungkil Biji Jatropha Kernel
meal dalam diet ikan mas (Cyprinus carpio L.) pada ekspresi hormon
pertumbuhan - dan insulin-like growth factor-1 - pengkodean gen
OLEH :
Ibnu Malkan Hasbi
P3300214005
PROGRAM MAGISTER ILMU
PERIKANAN
FAKULTAS ILMU KELAUTAN
DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014
PENDAHULUAN
Jatropha curcas adalah semak tahan
kekeringan atau pohon kecil di daerah tropis dan subtropis. Penggunaan J.
curcas (L) kernel meal pada pakan ikan terbatas karena adanya beracun dan
antinutritional konstituen. Dalam studi
ini, itu didetoksifikasi menggunakan perlakuan panas dan Metode ekstraksi
pelarut organik. Proses detoksifikasi dilakukan out selama 60 menit untuk
mendapatkan makanan didetoksifikasi. Cyprinus carpio L. bibit (N = 180, Avg berat 3,2 ± 0,07 g) secara acak
didistribusikan di lima kelompok perlakuan dengan empat ulangan dan diberi
makan diet isonitronenik (Protein kasar 38%) selama 8 minggu. Tingkat masuknya
didetoksifikasi Jatropha kernel meal (DJKM) dan bungkil kedelai (SBM) adalah
sebagai berikut: kontrol diet telah dipersiapkan dengan tepung ikan (FM) dan
makan gandum, tanpa setiap DJKM dan MBS, diet S50 dan J50:
50% protein FM digantikan oleh MBS dan DJKM masing-masing; diet S75
dan J75: 75% protein FM digantikan oleh MBS dan DJKM masing-masing.
Keuntungan massa tubuh tertinggi dan insulin-like growth factor-1 (IGF-1)
ekspresi gen di otak, hati dan otot diamati untuk kelompok kontrol, yang secara
statistik mirip dengan yang untuk kelompok J50 dan secara signifikan
(p <0,05) lebih tinggi dibandingkan untuk semua kelompok lain, sedangkan
pertumbuhan ekspresi gen hormon di otak, hati dan otot dipamerkan tren yang
berlawanan. Insulin-like growth factor-1 konsentrasi dalam plasma tidak berbeda
secara signifikan antara lima kelompok. Meyakinkan, kinerja pertumbuhan secara
paralel dengan IGF-1 ekspresi gen dan dipamerkan tren negatif dengan ekspresi
gen GH
PEMBAHASAN
Ikan makan (FM) masih merupakan protein
yang paling penting sumber untuk industri akuakultur, tapi ini adalah terbatas
pakan sumber daya, dan ada kekhawatiran serius pada ketersediaan jangka panjang
pakan ini untuk digunakan pada ikan diet. Dengan demikian, untuk pengembangan
lebih lanjut dari budidaya berdasarkan berkelanjutan dan terbarukan sumber
pakan, pengetahuan dasar pada fisiologis konsekuensi pengganti total atau
sebagian FM oleh sumber protein alternatif diperlukan. mengingat bahwa pakan
tanaman tersedia, mereka telah menerima banyak perhatian selama beberapa tahun
terakhir (Kumar et al, 2008, 2010a, 2011a, b;. Mazurkiewicz, 2009). Penggantian
sebagian besar FM oleh sumber protein nabati, terutama bungkil kedelai (MBS)
dalam diet ikan mas, telah dicapai (Kumar et al, 2008, 2010a, 2011a, b;. Mazurkiewicz,
2009), namun masalah yang terkait dengan ketidakseimbangan asam amino (NRC,
1993) dan faktor antinutritional (Francis et al., 2001) tidak diperbolehkan
sejauh total substitusi FM. Saat ini, sebagian besar komersial pakan sebagian
besar tergantung pada MBS sebagai pengganti FM. Namun, lebih dari
ketergantungan akan menyebabkan kenaikan harga MBS. Selain itu, SBM adalah
makanan manusia. Oleh karena itu, pemanfaatan protein nabati lainnya murah sumber
akan bermanfaat dalam mengurangi feed biayanya dan berkontribusi terhadap
ketahanan pangan.
Jatropha
curcas (L.) (jarak pagar) adalah sebuah multiguna dan pohon tahan kekeringan,
tersebar luas di seluruh daerah tropis dan subtropis. Ini adalah tanaman hardy,
tumbuh subur pada lahan kritis dan membutuhkan jumlah terbatas nutrisi dan air.
Bijinya telah secara ekstensif diteliti sebagai sumber minyak. Kernel biji
mengandung sekitar 60% minyak yang dapat dikonversi menjadi biodiesel
berkualitas tinggi pada transesterifikasi dan digunakan sebagai pengganti bahan
bakar solar. Kernel makan diperoleh setelah ekstraksi minyak adalah sangat baik
sumber nutrisi dan mengandung 58-62% crude protein (Makkar et al., 1997).
Tingkat penting asam amino (kecuali lisin) lebih tinggi di Jatropha kernel meal
daripada di SBM (Kumar dkk., 2010a, 2011a, b). Namun, kehadiran tingkat tinggi anti
nutrisi seperti tripsin inhibitor, lektin dan fitat dan komponen beracun utama
phorbol ester (PES) (Kumar et al., 2010a, 2011a, b) membatasi mereka digunakan
dalam pakan ikan. Antinutrients panas-labil, seperti protease inhibitor, dan lektin
mudah dinonaktifkan dengan pemanasan lembab (121º C). Sebuah metode untuk
detoksifikasi Jatropha kernel meal telah dikembangkan di kami laboratorium. Hal
ini didasarkan pada ekstraksi menggunakan PES pelarut organik (metanol basa,
dan Makkar Becker, 2010) dan inaktivasi tripsin inhibitor dan lektin dengan
perlakuan panas.
Dimasukkannya
didetoksifikasi Jatropha kernel meal ( DJKM ) atau didetoksifikasi Jatropha
isolat protein pada 50 % penggantian protein FM dalam diet ikan menunjukkan efek
menguntungkan pada kinerja pertumbuhan dan pakan pemanfaatan . Namun , pada
tingkat > 50 % penggantian Protein FM , kinerja yang menurun telah direkam (
Kumar et al . , 2008, 2010a , b , 2011a , b ) , yang telah didalilkan sebagai
akibat pencernaan yang lebih rendah Jatropha protein dan / atau penyerapan
amino asam dan nutrisi lain dari kolam plasma dan pemanfaatannya ( Kumar et al
. , 2008). Faktor gizi dapat memberi efek tertentu pada regulasi endokrin
pertumbuhan dan metabolisme di mana hormon pertumbuhan ( GH ) dan insulin -like
growth factor- 1 ( IGF - 1 ) memainkan
peran sentral. Pertumbuhan Hormon diproduksi dan disekresikan dari kelenjar di
bawah otak , sedangkan beredar IGF - 1 terutama dirilis dari hati setelah
stimulasi GH . Pada ikan seperti di mamalia , sekresi IGF-I juga tergantung
pada ketersediaan energi dan mengerahkan umpan balik negatif efek pada sekresi
GH ( Duan , 1998) . Kedua GH dan IGF - 1 pengobatan telah ditunjukkan untuk
merangsang pertumbuhan ikan , namun kontribusinya relatif mereka dan sejauh
mana GH dan IGF - 1 berinteraksi dan / atau bertindak secara independen untuk
mengatur pertumbuhan dan proses metabolism belum jelas ( Bjo ¨ rnsson et al . ,
2002) . itu GH - IGF - 1 sumbu sangat dipengaruhi oleh gizi status ikan ,
misalnya , puasa atau menurun diet protein / energi ransum umumnya ditandai
dengan peningkatan konsentrasi plasma GH dan penurunan IGF - 1 konsentrasi plasma
( Wagner dan McKeown , 1986; Sumpter et al , 1991; . Moriyama et al , 1994; .
Pe'rez - Sa'nchez et al , 1995; . Johnsson et al , 1996; . Martı' - Palanca et
al , 1996; . Pierce et al . , 2005) . Penelitian terbaru juga menunjukkan bahwa
diet sumber protein dapat mempengaruhi konsentrasi plasma GH ,tapi tidak IGF -
1 tingkat , di trout pelangi dan gilthead sea bream ( Go ' mez - Requeni et
al . , 2004, 2005 ) . Selain itu, komposisi asam amino seimbang diet diubah
plasma GH dan IGF - 1 tingkat di gilthead seabream ( Go'mez - Requeni et al . ,
2003) . Namun , pengaruh faktor makanan tertentu pada GH - IGF - 1 sumbu ikan
mas belum baik dipelajari . Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi pengaruh menggabungkan DJKM (
merupakan produk dari industri biodiesel ) dalam diet terhadap ekspresi GH and Gen
IGF - 1 - encoding di ikan mas ( Cyprinus c9arpio L. ) dan membandingkannya
dengan MBS – dan FM yang mengandung diet .
Bahan
dan metode
Persiapan makanan Jatropha Biji jarak
pagar diperoleh dari India dan deshelled manual untuk mendapatkan kernel.
defatting dari Jatropha kernel dilakukan dengan menggunakan minyak benzena
(b.p. 40-60ºC) dalam alat Soxhlet. Pelarut organik (basa metanol) digunakan
untuk detoksifikasi lemaknya Jatropha kernel meal (Makkar dan Becker, 2010).
Setelah penghapusan PES, makanan adalah diautoklaf (121ºC) untuk menghilangkan
antinutrients panas-labil, tripsin inhibitor dan lectin.
Formulasi
diet
Ikan makan (Seelo ¨ kita tepung ikan)
yang diperoleh dari Vereinigte Fishmeh Werke Cuxhaven KG GmbH, Cuxhaven,
Jerman, makan gandum dibeli dari pasar lokal. SBM (dehulled, seluruhnya
dipisahkan dan roasted) diperoleh dari Institut Hewan Nutrisi (450),
Universitas Hohenheim, Jerman. Isolat protein kedelai (Supro? 500E IP) dibeli dari
Solae Eropa S.A., Geneva, Swiss. Sumber minyak bunga matahari adalah Thomy,
Nestle Deutchland AG, Neuss, Gernany; Reg. Merek dagang dari Societedes,
Produits Nestle SA Vitamin premix, dan premix mineral tersebut dibeli dari
Altromin Spezialfutter GmbH KG, Lage, Jerman. Sumber lisin adalah Merck KGaA,
Darmstadt, Jerman.
Sebelum
memberi makan formulasi, komposisi proksimat dari lemaknya Jatropha kernel,
tepung gandum, MBS, protein kedelai mengisolasi dan FM ditentukan. Sebanyak
tujuh diet isonitronenik dan isoenergetic dirumuskan. Pakan yang mengandung protein
kasar 38%, lemak kasar 8%, vitamin premix 2%, mineral premix 2% dan TiO2 1%
siap. Lisin telah dilengkapi pada tingkat 1% dari DJKM dimasukkan dalam diet.
Setiap pakan eksperimental, kecuali kontrol, terdapat 500 FTU phytase (NATUPHOS
5000G, BASF, Ludwigshafen, Jerman) per kg. Tingkat masuknya DJKM dan SBM yang
dijelaskan di bawah ini. Kontrol diet dipersiapkan dengan FM dan gandum makan,
tanpa DJKM dan MBS, sebagai berikut: S50, 50% dari protein FM digantikan oleh
SBM, S75, 75% dari Protein FM digantikan oleh SBM, J50, 50% protein FM digantikan
oleh DJKM, dan J75, 75% protein FM digantikan oleh DJKM. Campuran akhir dari
setiap diet dibuat untuk pelet basah 2-mm-diameter menggunakan Bosch, Tipe
UM60ST 2-M pelet (Robert Bosch Hausgerate GmbH, Gerlingen, Jerman) dan kemudian
beku-kering (Tabel 1).
Sistem
eksperimental dan hewan
Ikan
mas (Cyprinus carpio L.) bibit (sekitar 2,0-3,0 g) dari Institut Perikanan Ekologi
dan Budidaya dari Riset Federal Pusat Perikanan di Ahensburg, Jerman, yang ditransfer
ke University of Hohenheim, Stuttgart, Jerman, dan disimpan dalam dua tangki
500-L-kapasitas aklimatisasi. Mereka diberi makan standar Hohenheim diet ikan
yang mengandung sekitar 38 protein%, 8% lemak, 10% abu dan dengan kandungan
energi bruto 18,5 kJ/ g bahan kering. Setelah periode aklimatisasi 20 hari, 180
ikan secara acak didistribusikan ke dalam lima kelompok dengan empat ulangan,
setiap ulangan yang terkandung sembilan ikan (rata-rata berat. 3.2 ± 0,07 g)
dalam akuarium (45 l capacity). Semua akuarium itu disediakan dengan air dari
sistem recirculatory. System menjadi sasaran sebuah penyinaran dari 12 jam
light/12 h kegelapan. Kualitas air dimonitor selama percobaan. Semua parameter
air berada di kisaran optimum (suhu, 26,2-27,1 _c, pH, 7,0-7,5, oksigen
terlarut, 6,9-7,4 mg / l, total NH3, 0,1-0,2 mg / l; nitrit, 0,07-0,1 mg / l,
dan nitrat, 1-3 mg / l). Aliran air telah disesuaikan untuk menjaga oksigen saturasi
diatas 80%. Satu hari sebelum awal percobaan, ikan yang kelaparan, dan selama
periode percobaan, ikan diberi makan pukul 16 g pakan per kg massa tubuh
metabolik (kg0.8) per hari (setara dengan lima kali kebutuhan energi
pemeliharaannya). Jumlah pakan per hari dibagi menjadi lima porsi sama, dan setiap
bagian diberikan pada 08:00, 10:30, 13:00, 15:30 dan 18:00. Feed yang dibagikan
menggunakan feeder otomatis. Ikan ditimbang secara individual
pada awal percobaan (avg. berat. 3.2 ±
0,07 g) dan pada interval mingguan selama periode percobaan untuk mengatur
tingkat makan untuk minggu berikutnya. Ikan tidak diberi makan pada berat hari.
Percobaan
itu dihentikan setelah 8 minggu, dan ikan tewas. Pada akhir eksperimen, ikan yang
anaesthesized oleh tricaine methanesulfonate (MS222) pada 250 ppm dalam air.
Darah diambil dekat pangkal ekor dari satu ikan dari masing-masing ulangan ,
dan dipindahkan ke dalam tabung heparinized. Darah disentrifugasi pada 1500 g
selama 5 menit pada suhu kamar (24 _c) plasma untuk mendapatkan, yang kemudian disimpan
pada) 20 _c untuk penentuan IGF-1. Satu ikan per ulangan hati-hati dibedah
untuk mengisolasi otot, hati dan otak dan tersimpan dalam nitrogen cair (at)
180 _c) untuk analisis ekspresi GH-dan gen IGF-1-encoding.
Ekstraksi
dan estimasi ester phorbol (PES) oleh kromatografi cair kinerja tinggi dan
tekad dari antinutrients
Ester phorbol ditentukan menurut metode dari
Makkar et al. (2007), yang didasarkan pada metode Makkar et al. (1997). Secara
singkat, 0,5 g Jatropha kernel meal dan ikan kering seluruh tubuh Sampel
diekstraksi empat kali dengan metanol. A alikuot cocok dimuat pada kinerja
tinggi kromatografi cair (HPLC) reverse-fase C18 Li- Chrospher 100, 5 lm (250 ·
4 mm) I.D. dari Merck (Darmstadt, Jerman) kolom. Kolom itu dilindungi dengan
kolom yang berisi kepala yang sama material. Pemisahan ini dilakukan di ruang suhu
(23 ° C), dan laju alir 1,3 ml / min menggunakan elusi gradien (Makkar et al.,
2007). Puncak empat PES terdeteksi pada 280 nm dan muncul antara 25,5 dan 30,5
menit. Hasil dinyatakan sebagai setara dengan standar, phorbol- 12-miristat
13-asetat. Batas deteksi PES adalah 3 lg / g makan. Aktivitas inhibitor tripsin
ditentukan dasarnya menurut Smith et al. (1980) kecuali bahwa enzim ditambahkan
terakhir seperti yang disarankan oleh Liu dan Markakis (1989). Analisis isi
adalah lectin dilakukan dengan uji haemagglutination (Makkar et al., 1997).
Kegiatan haemagglutination adalah dinyatakan sebagai jumlah minimum bahan (mg
/ml media assay) yang menghasilkan aglutinasi. Itu jumlah minimum adalah jumlah
bahan per ml media uji dalam pengenceran tertinggi yang
positif bagi aglutinasi, semakin rendah
nilai ini, tinggi aktivitas lektin. Fitat konten sampel ditentukan dengan
prosedur spektrofotometri (Vaintraub dan Lapteva, 1988). hasil yang dinyatakan
sebagai g asam fitat per 100 g bahan menggunakan fitat acid sodium salt (Sigma,
St Louis, MO, USA) sebagai standar. Polisakarida non-pati (NSP) yang diperkirakan
menurut Englyst et al. (1994).
Analisis asam amino
Komposisi
asam amino dari FM, DJKM, SBM, konsentrat protein kedelai dan tepung terigu
yang ditentukan dengan menggunakan penganalisis asam amino otomatis setelah
menghidrolisa sampel dengan 6 M HCl pada 110 _c selama 24 jam (Bassler dan
Buchholz, 1993). Itu asam amino yang mengandung sulfur yang dioksidasi
menggunakan asam performic sebelum hidrolisis asam. Triptofan Isi dari sampel
tersebut di atas adalah ditentukan secara spektrofotometri dengan metode Pinter-Szakacs
dan Molnar-Perl (1990).
Analisis
proksimat
Komposisi proksimat bahan diet dan diet ditentukan
dengan menggunakan metode standar Asosiasi Kimiawan Official Analytical (AOAC,
1990). Sampel FM dianalisis untuk kering materi, abu, protein kasar dan lemak
(eter-larut lipid). Energi bruto bahan diet dan diet adalah ditentukan dengan
kalorimeter bom (IKA C7000) menggunakan asam benzoat sebagai standar.
Parameter
pertumbuhan
Pertumbuhan kinerja dalam hal keuntungan
massa tubuh (BMG) dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
BMG(%)={( massa tubuh Final -
badan awal mass)/awal massa tubuh} x 100
Penentuan
Radioimmunological IGF-I
Insulin-seperti
faktor pertumbuhan-1 konsentrasi dalam plasma ditentukan radioimmunologically
setelah asam ekstraksi etanol menggunakan heterolog sensitive assay mendasarkan
pada hIGF-I seperti yang dijelaskan dan divalidasi untuk pengukuran dalam
plasma babi (Claus dan Weiler, 1996). Carp IGF-I adalah sekitar 80% homolog untuk
hIGF-I (Duan, 1998), dan keandalan assay heterolog untuk penentuan ikan mas Sampel
diperiksa dengan penentuan paralelisme seperti dijelaskan kemudian. Secara
singkat, sampel 50 ll mas plasma diinkubasi dengan 400 ll HCl-etanol dan
disentrifugasi. 100 ll supernatan dinetralkan dengan 40 ll Tris-base (0.855 M)
dan selanjutnya diencerkan dengan 200 penyangga assay ll. seratus microlitres pengenceran
ini digunakan dalam pengujian dalam rangkap dua. 125I-hIGF-I digunakan sebagai
pelacak dan telah dipersiapkan menurut metode Iododgen (Salacinski et al.,
1981). Aktivitas spesifik adalah 95 GBq / nmol. Antibodi pertama telah diangkat
pada kelinci terhadap tinggi I-thyroglobulin dan digunakan pada pengenceran
akhir dari 1:90,000. Antiserum mengungkapkan reaktivitas silang dari 1,2%
dengan pIGF-II, dan reaktivitas silang dengan ikan mas IGF-II belum ditentukan.
Sedetik antibodi (domba antirabbit) digunakan untuk pengendapan dari antibodi
pertama. Setelah sentrifugasi, yang supernatan dibuang dan pelet dihitung dalam
c-counter. Paralelisme ditentukan dengan mengukur aliquot 100-10 akan diekstrak
dan dinetralkan sampel, dan korelasi antara konsentrasi dan volume sampel
adalah 0,99. Batas bawah sensitivitas adalah 15 pg / tabung. Variasi interassay
berkisar antara 8,1% dan 10,1%, dan intra-assay Variasi adalah 10,0%
Ekspresi
GH dan IGF-1 gen
Isolasi
RNA total
RNA total diisolasi dari otak (termasuk hipofisis
kelenjar), hati dan otot jaringan ikan mas oleh Trizol standar? Metode
ekstraksi Reagen (cat # 15.596-026, Invitrogen, Frankfurt, Jerman). Contoh
jaringan dihomogenisasi dalam 1 ml Trizol? Reagen per 50 mg jaringan. RNA
dibubarkan di diethylpyrocarbonate (DEPC)-diperlakukan air dengan solusi
melewati beberapa kali melewati ujung pipet. RNA total diobati dengan 1 U RQ1
RNAsefree DNAse (Invitrogen) untuk dicerna residu DNA dan kembali tersuspensi
dalam air DEPC-diobati. Kemurnian total RNA dinilai dengan rasio 260/280 nm
(antara 1,8 dan 2,1). Selain itu, integritas yakin dengan etidium bromida
analisis noda 28S dan 18S band oleh formaldehida yang mengandung agarosa gel
elektroforesis. Aliquots segera digunakan untuk transkripsi terbalik (RT).
Transkripsi
terbalik (RT) reaksi
Poli
lengkap (A) + RNA diisolasi dari umum jaringan ikan itu terbalik ditranskripsi
menjadi cDNA dalam total volume 20 ll menggunakan RevertAid? Strand pertama cDNA
Sintesis kit (MBI Fermentas, Sankt Leon-Rot, Jerman). Sejumlah RNA total (5 lg)
digunakan dengan campuran reaksi, disebut sebagai master mix (MM). MM itu
terdiri dari 50 mM MgCl2, 5 · RT penyangga (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3),
10 mM masing-masing dNTP, 50 Lm oligo-dT primer, 20 U ribonuklease inhibitor (50
kDa enzim rekombinan untuk menghambat Aktivitas
RNase) dan 50 U M-MuLV reverse transcriptase. RT reaksi dilakukan pada 25º C
untuk 10 menit, diikuti dengan 1 jam pada 42º C, dan reaksi dihentikan dengan pemanasan
selama 5 menit pada 99º C. Setelah itu, tabung reaksi yang mengandung persiapan
RT yang flash didinginkan dalam ruang es sampai digunakan untuk amplifikasi DNA
melalui semi-kuantitatif real-time polymerase chain reaction (PCR-sqrt).
Semi-kuantitatif
Real-time Polymerase Chain Reaction (SQRT-PCR)
Sebuah
iQ5-RAD BIO-Cycler (Cepheid, Karibia Drive, Sunnyvale, CA, AS) digunakan untuk
menentukan ikan mas jumlah salinan cDNA. PCR didirikan di 25 campuran reaksi
mengandung 12,5 ll ll 1 • SYBR_ Premix Ex Taq_ (TAKARA Biotech, Saint- Germain-en-Laye,
Prancis), 0,5 ll 0,2 Lm primer sense, 0,5 ll 0,2 lm antisense primer, 6,5 ll
air suling dan 5 ll Template cDNA. Program Reaksi dialokasikan tiga langkah.
Langkah pertama adalah pada 95.0_C selama 3 menit. Langkah kedua terdiri dari
40 putaran di mana setiap siklus dibagi tiga langkah: (i) pada 95.0_C untuk 15
s, (ii) di 55.0_C selama 30 s, dan (iii) di 72.0_C untuk 30 s. Langkah ketiga
terdiri dari 71 putaran yang dimulai pada 60.0_C dan kemudian meningkat sekitar
0.5_C setiap s 10 hingga 95.0_C. Pada akhir setiap sqrt-PCR, analisis kurva
pencairan dilakukan pada 95.0_C untuk memeriksa kualitas primer yang digunakan.
masing-masing eksperimen termasuk kontrol air suling. Nilai-nilai
semi-kuantitatif RT-PCR (sqRTPCR) GH (GH-F: 5 ¢-CGG AAT TCG ACA ACC AGC GGC
TGT-3 ¢, GH-R: 5 ¢-CGC GGA TCC TTA CTA CAG GGT GCA GTT G-3 ¢, Li et al., 2003)
dan IGF-1 (IGF1-P: 5 ¢-GTC TAG CGC TCT TTC TT C TC-3 ¢, IGF1-kanan: bintang 5
¢-TCC TAC GCT CTG TGC CTT TG-3 ¢, Pedroso et al, 2006.) gen dinormalisasi atas
dasar b-aktin (b-aktin-F: 5 ¢ ACT CAC-GTG ATC CCC TAC GA-3 ¢, B-aktin-R: 5 ¢
TCC-TTC TGC ATC CTG TCA GC-3 ¢, Wong dkk., 2001) ekspresi. Di akhir setiap
sqrt-PCR, kurva leleh Analisis dilakukan
pada 95.0? C memeriksa kualitas dari
primer yang digunakan.
Perhitungan
Ekspresi Gen
Pertama, efisiensi amplifikasi (Ef)
dihitung dari kemiringan kurva standar
menggunakan berikut
formula (Bio-Rad, 2006):
Ef ¼ 10? 1 = kemiringan
Efficiencyð% Þ def ¼? 1th? 100
Relatif kuantifikasi target untuk referensi
ditentukan dengan menggunakan metode DCT
jika E
untuk target (GH, IGF-1) dan primer
referensi (B-aktin) adalah sama
(Bio-Rad, 2006):
Ratioðreference = targetgeneÞ ¼ EfCTðreferenceÞ? CTðtargetÞ
Efisiensi
amplifikasi (Ef) bagi GH dan IGF-1 adalah
1,993 (Ef% = 99,3) dan 1,988 (Ef% = 98,8), masing, sedangkan kondisi PCR menunjukkan bahwa lereng GH dan IGF-1 adalah) 3.34, dan )
3.35 masing-masing. Selanjutnya, untuk memastikan bahwa efisiensi PCR (Ef = 10) 1 / s) 1) adalah serupa antara sampel
V. Kumar et al. Pengaruh jarak pagar
makan di ikan mas diet pada GH dan IGF-1 ekspresi gen Jurnal Fisiologi Hewan and Animal Nutrition. ª
2011 Blackwell Verlag GmbH 101 serta
standar, yang dekat dengan 2, kami menganalisis baik penambahan produk RT untuk reaksi campuran untuk kurva standar yang disiapkan Untuk dimurnikan RNA mempengaruhi efisiensi
PCR.
Analisis
statistik
Semua
data menjadi sasaran analisis satu arah varians (ANOVA), dan signifikansi
perbedaan antara berarti diuji dengan Tukey honestly signifikan perbedaan (HSD)
test (p <0,05). perangkat lunak ini digunakan adalah SAS, Versi 9.1
(StatSoft, Tulsa, OK, USA). Nilai dinyatakan sebagai berarti ± deviasi standar.
Hasil
Ester phorbol, dan isi antinutrient di
defatted Jatropha kernel meal Isi ester phorbol di lemaknya Jatropha kernel makan
adalah 1,6 mg / g. Namun, PES di DJKM yang dikurangi ke tingkat tidak
terdeteksi. Sensitivitas dari Metode adalah 5 lg / g kernel meal. Tripsin
inhibitor, dan lektin tidak terdeteksi di MBS dan DJKM. Fitat tingkat di DJKM
dan MBS adalah 9,5% dan 2,5%, masing-masing, sedangkan tingkat NSP di MBS dan
DJKM adalah 14, dan 16%% berturut-turut.
Antinutrients
komposisi proksimat dan asam amino Profil bahan pakan, dan diet
Komposisi proksimat dan komposisi asam
amino pakan bahan yang ditampilkan dalam Tabel 2. The proksimat dan komposisi
asam amino dari berbagai pakan (% bahan kering) disajikan dalam Tabel 3. Diet
yang terkandung sekitar 38% minyak mentah protein dan 18,5 MJ / kg energi kotor
dan isonitronenik dan isoenergetic. Bahan kering, lemak kasar dan abu berada
pada kisaran 94,4-96,1%, 8,3-8,8%, dan 10,3-11,1% berturut-turut. Semua diet
eksperimental memiliki komposisi asam amino hampir sama. Semua diet yang
mengandung asam amino esensial pada dasarnya sesuai kebutuhan dari ikan mas
(NRC, 1993).
kinerja
Pertumbuhan
Keuntungan massa tubuh Mingguan (g) ikan
diberikan dalam Gambar. 1. BMG (%) ikan pada akhir periode percobaan disajikan
pada Gambar. 2. Mingguan BMG menunjukkan bahwa minggu kedua dan seterusnya, ada
Pertumbuhan diferensial antara kelompok, dan lebih rendah pengembangan massa
tubuh diamati pada J75 kelompok. Setelah itu, minggu ke-5 dan seterusnya, massa
tubuh lebih rendah pengembangan diamati untuk S75 kelompok juga. Kecenderungan
ini dipertahankan sampai akhir percobaan. BMG tertinggi diamati untuk kelompok
J50, yang secara statistik tidak berbeda (p> 0,05) untuk bahwa untuk
kelompok kontrol dan secara signifikan (p <0,05) lebih tinggi dibandingkan
semua kelompok lain.
IGF-1
konsentrasi dalam plasma dan ekspresi GH dan IGF-1 gen
Data plasma IGF-1 konsentrasi dan
ekspresi GH dan IGF-1 gen dalam otak, hati dan otot ditunjukkan dalam Gambar
3-5. Insulin-like factor-1 pertumbuhan gen Ekspresi berbanding lurus dengan BMG
ikan. 1 IGF-ekspresi gen tertinggi di otak, hati, dan otot diamati pada
kelompok kontrol, yang secara statistic tidak berbeda (p> 0,05) ke J50
kelompok dan lebih tinggi (p <0,05) dibandingkan kelompok lain, sedangkan GH
ekspresi gen dipamerkan tren yang berlawanan. Diet pengobatan tidak
mempengaruhi secara signifikan total jumlah IGF-1 konsentrasi dalam darah.
Sebagai karakteristik fitur, plasma konsentrasi IGF-1 numerik menurun dengan
peningkatan FM
pengganti, tetapi efek ini tampak lebih
jelas di SBM-makan kelompok ikan.
Diskusi
Dalam penelitian ini, hasil menunjukkan
bahwa DJKM pada tingkat inklusi yang lebih rendah (J50, protein 50% FM digantikan
oleh DJKM) merupakan sumber protein yang baik untuk ikan mas umpan. Kinerja
pertumbuhan ikan mas makan J50 diet adalah lebih baik daripada diet SBM
berbasis dan mirip dengan bahwa diet berbasis FM. Kinerja sedikit lebih rendah ikan
makan diet mana DJKM diganti 75% dari FM protein menyarankan bahwa kapasitas
DJKM untuk sepenuhnya mempertahankan pertumbuhan sedikit lebih rendah
dibandingkan dengan diet kontrol. Respons pertumbuhan signifikan lebih rendah 75%
protein nabati-makan kelompok mungkin karena beberapa faktor seperti daya cerna
rendah protein dan energi dalam diet (Kumar et al., 2011a, b), yang dapat
menyebabkan protein yang lebih rendah dan ketersediaan energy dari DJKM dan
MBS. antinutrients seperti sebagai fitat dan NSP tersedia dalam jumlah yang
tinggi dalam SBM dan DJKM yang bisa mempengaruhi pemanfaatan pakan yang
mengarah pada kinerja pertumbuhan yang lebih rendah. Tampaknya ikan diet makan
dengan tinggi protein nabati rasio menunjukkan defisit energi fana sebagai
hasil terutama dari penurunan kinerja pertumbuhan, yang bersesuaian dengan data
yang sama ikan mas dan trout pelangi (Gomes et al, 1993.; Hasan et al, 1997;.
Mazurkiewicz, 2009; Kumar et al., 2010a, 2011a, b).
GH-IGF-1 jaringan memainkan peran
integral dalam pertumbuhan mamalia (Jones, dan Clemmons, 1995). Cao et al.
(2009) telah menyarankan bahwa IGF-1 adalah hormon penting yang terlibat dalam
pertumbuhan ikan mas. Untuk yang terbaik pengetahuan kami, ini adalah studi
pertama menunjukkan korelasi dengan plasma IGF-1 konsentrasi dan GH dan IGF-1
ekspresi gen dengan kinerja pertumbuhan ketika common ikan mas makan dengan DJKM
sebagai sumber protein. Penelitian ini bertujuan untuk mengukur tingkat GH dan
IGF-I mRNA dalam otak (pituitary termasuk), hati dan otot untuk mencari
mendasari mekanisme pendorong perbedaan hormon beredar dalam kaitannya dengan
makan dan untuk menyarankan apakah GH juga disajikan dalam jaringan
extrapituitary seperti otot dan hati. Temuan kami konsisten dengan mereka dari
Yang dkk. (1999) dan Tymchuk et al. (2009). Mereka menemukan bahwa tingkat mRNA
GH yang terdeteksi di beberapa seperti jaringan kelenjar pituitari, otak,
insang, jantung, ginjal, otot dan hati rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), dan
coho salmon (Oncorhynchus kisutch).
GH - IGF -I axis memberikan sinyal
terintegrasi untuk pertumbuhan dan partisi hara ( Beckman , dan Dickhoff ,
1998; Mingarro et al , 2002) . . Pada saat ini belajar untuk semua kelompok
diet , ada keseluruhan negatif korelasi antara GH ekspresi gen dan kinerja
pertumbuhan. Kinerja pertumbuhan tertinggi diamati untuk J50 kelompok , yang statistik
serupa ( p > 0,05 ) dengan untuk control kelompok dan secara signifikan ( p
< 0,05 ) lebih tinggi dibandingkan semua kelompok lain , sedangkan ekspresi
gen GH dipamerkan tren yang berlawanan . Hal ini juga sejalan dengan data dari
salmon dan jenis ikan lain yang menunjukkan konsentrasi GH meningkat selama
periode diperpanjang puasa atau pakan pembatasan ( Wagner dan McKeown , 1986,
Sumpter et al , 1991; . Pe'rez - Sa'nchez et al , . 1995, Pierce dkk , 2005) . Hasil
korelasi dari pengaruh umpan balik negatif dari IGF - I pada GH sekresi , yang
memastikan pada ikan seperti pada mamalia tingkat GH tinggi selama kelaparan
untuk mempromosikan lipolisis ( Duan , 1998) . Meski ikan di masa kini studi
yang ditawarkan pakan dengan lima kali perawatan mereka persyaratan , dengan
demikian tampak bahwa yang berbeda fisiologis ( pemanfaatan pakan menurun )
respon dengan diet yang berbeda , yang mengarah untuk menurunkan gizi serapan
J75 dan S75 kelompok dibanding control dan J50 kelompok , pada gilirannya
menyebabkan peningkatan dalam relatif ekspresi gen GH di otak , hati dan otot.
Alasan untuk ini mungkin bahwa GH memiliki tindakan metabolisme penting , dan
salah satu fungsi nya selama kondisi gizi buruk mungkin untuk melindungi
protein dan lipid memobilisasi energi dari ( Bjo ¨ rnsson , 1997) . Hal ini
didukung oleh fakta bahwa dalam penelitian ini berdasarkan rasio konversi pakan
(tanggal tidak ditampilkan) adalah tren yang berlawanan terhadap kinerja
pertumbuhan dan sejajar dengan ekspresi gen GH di otak, hati dan otot . Hasil
kami setuju dengan Aksnes et al . ( 2006) , dimana mereka mengamati ‡ bahwa
protein FM 75 % diganti dengan campuran sumber protein nabati ( MBS , kedelai
konsentrat protein , gluten tepung jagung , gluten gandum , diekstrusi kacang
polong , lobak makan ) seimbang dengan sangat diperlukan asam amino dalam
rainbow trout dan gilthead laut bream menyebabkan peningkatan konsentrasi GH di
plasma dan ekspresi gen GH hati. mereka menyimpulkan bahwa kinerja pertumbuhan
terbalik berhubungan dengan ekspresi gen GH , kecenderungan yang sama memiliki telah
diamati dalam penelitian kami
Mounting
bukti menunjukkan bahwa IGF-1 memainkan peran serupa dalam pertumbuhan ikan
(Duan, 1997, 1998; Moriyama et al., 2000). Perez-Sanchez dan Le Bail (1999)
pertama kali diusulkan bahwa jaringan GH-IGF-1 dapat digunakan sebagai penanda
pertumbuhan kinerja dan status gizi pada ikan budidaya. kita sekarang belajar
ditunjuk bahwa konsentrasi IGF-1 tingkat dalam plasma tidak berbeda (p>
0,05) antara perlakuan kelompok, tetapi sesuai angka dengan IGF- 1 ekspresi gen
dalam hati otot dan otak antara pengobatan. IGF-1 ekspresi gen relatif otot,
hati dan otak adalah tertinggi untuk J50 kelompok, yang secara statistik tidak
berbeda dengan untuk kelompok kontrol, dan secara signifikan (p <0,05) lebih
tinggi dibandingkan semua kelompok lain, yang sejajar dengan kinerja
pertumbuhan. Hasil kami dalam perjanjian dengan Go 'mez-Requeni et al. (2004),
Dyer et al. (2004), Aksnes et al. (2006) dan Li et al. (2006), dimana mereka
telah mengamati bahwa IGF-1 secara parallel dengan angka pertumbuhan di trout,
sea bream, channel cat fish, barramundi dan salmon Atlantik. Hasil penelitian
ini dan studi Dyer et al. (2004) menunjukkan bahwa ekspresi mRNA dan beredar konsentrasi
plasma IGF-1 adalah alat yang berguna untuk memprediksi tingkat pertumbuhan
ikan.
Konsentrasi IGF - 1 tingkat dalam plasma
tidak berbeda secara signifikan ( p > 0,05 ) antara perlakuan Gambar . 4
Plasma insulin - seperti faktor pertumbuhan - 1 konsentrasi kesamaan ikan mas (
Cyprinus carpio L. ) setelah 8 minggu percobaan yang berbeda kelompok . Setiap
nilai rata-rata ( n = 4 ) ± standar deviasi . berarti nilai dengan huruf yang
berbeda berbeda secara signifikan ( p < 0,05 ) . Gambar . 5 Nilai
semi-kuantitatif insulin - like growth factor ( IGF - 1 ) ekspresi gen di otak
( IGF - 1 - B ) , hati ( IGF - 1 - L ) dan otot ( IGF - 1 - M ) ikan mas (
Cyprinus carpio L. ) dari kelompok eksperimen berbeda . Setiap nilai rata-rata
( n = 4 ) ± standar deviasi . Berarti nilai dengan berbagai huruf berbeda
secara signifikan ( p < 0,05 ) . V. Kumar et al . Pengaruh jarak pagar makan
di ikan mas diet pada GH dan IGF - 1 ekspresi gen Jurnal Fisiologi Hewan dan
Nutrisi Ternak . ª 2011 Blackwell Verlag GmbH 105 kelompok, tetapi secara
numerik , itu sejalan dengan pertumbuhan data kinerja . Hasil kami setuju
dengan Go ' mez - Requeni et al . ( 2004, 2005 ) , dimana mereka menunjukkan
bahwa sumber protein diet dapat mempengaruhi konsentrasi plasma GH , tapi tidak
IGF - 1 tingkat , di trout pelangi dan gilthead sea bream . IGF - 1 adalah terlibat
dalam GH umpan balik negatif ( Perez - Sanchez dkk , 1992; . Weil dkk , 1999) ,
dan konsisten. perubahan konsentrasi plasma GH terjadi pada menanggapi
pergeseran dalam ukuran ransum dan makanan protein /Rasio energi ( Perez -
Sanchez et al , 1995; . Martı' - Palanca et al , 1996; . Perusahaan et al ,
1999) . . Go'mez - Requeni et al . ( 2003 ) menunjukkan bahwa perubahan asam
amino diet esensial dan non – esensial konten dalam diet dapat menginduksi
beberapa Negara hati resistensi GH dalam hubungannya dengan penurunan tingkat
pertumbuhan . Dibandingkan dengan ikan yang diberi pakan FM diet , tidak ada
perubahan dalam J50 dan S50 kelompok ( 50 % penggantian protein FM oleh MBS dan
DJKM makan masing-masing) yang ditemukan, tetapi pada J75 dan S75 kelompok ( 75
% penggantian protein FM ) , peningkatan GH tingkat ekspresi sejajar dengan
penurunan IGF –I ekspresi gen . Semua ini mengungkapkan keadaan GH – hati desensitisasi
, yaitu karena berkurangnya ekspresi reseptor GH dalam hati , karakteristik Fitur
negara katabolic (Gambar 3 ) . Singkatnya , penelitian kami menunjukkan
concurrent down-regulasi GH ekspresi ketika perbandingan dibuat antara kelompok
yang berbeda sedangkan tren sebaliknya tercatat
untuk gen IGF-1 tingkat ekspresi (Gambar
5 ) .
Kesimpulan
Kinerja
pertumbuhan paralel dengan gen IGF-1 berekspresi dan dipamerkan tren negatif
untuk gen GH berekspresi. Phorbol ester, prinsip beracun utama untuk Jatropha
toksisitas, tidak terdeteksi pada otot ikan jaringan, menunjukkan bahwa ikan
tersebut aman pada manusia konsumsi.
Pengakuan
Penelitian ini didukung oleh
Bundesministerium yang fu ¨ r Bildung und Forschung (BMBF), Berlin, Jerman.
Kami berterima terima Dominique Lorenz, Hermann Baumgartner dan Beatrix Fischer
dari kami laboratorium untuk bantuan mereka dalam analisis data
References
Aksnes, A.;
Hope, B.; Jo¨ nsson, E.; Bjo¨ rnsson, B. T.; Albrektsen, S., 2006: Size fractionated
fish hydrolysate as feed ingredient for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed
high plant protein diets. I: growth, growth regulation and feed utilization. Aquaculture
261, 305–317.
AOAC, 1990:
Official Methods of Analysis, 15th edn. Association of Official Analytical
Chemists, Arlington, VA.
Bassler, R.;
Buchholz, H., 1993: Amino acid analysis. Methodenbuch, Die Chemische
Untersuchung von Futtermitteln, Vol III. VDLUFA-Verlag, Darmstadt, pp. 1–5, Section
4.11.1.
Beckman, B. R.;
Dickhoff, W. W., 1998: Plasticity of smolting in spring chinook salmon:
relation to growth and insulin-like growth factor-I. Journal of Fish Biology 53,
808–826.
Bio-Rad
Laboratories, 2006: Real-time PCR applications guide. Bulletin 5279: 101 pp.
Bjo¨ rnsson, B.
T., 1997: The biology of salmon growth hormone: from daylight to dominance.
Fish Physiology and Biochemistry 17, 9–24.
Bjo¨ rnsson, B.
T.; Johansson, V.; Benedet, S.; Einarsdottir, I. E.; Hildahl, J.; Agustsson,
T.; Jo¨ nsson, E., 2002: Growth hormone endocrinology of salmonids: regulatory mechanisms
and mode of action. Fish Physiology and Biochemistry 27, 227–242.
Cao, Y.; Chen,
X.; Wang, S.; Chen, X. C.; Wang, Y. X.; Chang, J. P.; Du, J. Z., 2009: Growth
hormone and insulin-like growth factor of naked carp (Gymnocypris przewalskii)
in Lake Qinghai: expression in different water environments. General and Comparative
Endocrinology 161, 400–406.
Claus, R.;
Weiler, U., 1996: Relationships between IGF-I, cortisol, and osteocalcin. Experimental
and Clinical Endocrinology & Diabetes 104, 344–349.
Company, R.;
Calduch-Giner, J. A.; Kaushik, S.; Pe´rez- Sa´nchez, J., 1999: Growth
performance and adiposity in gilthead sea bream (Sparus aurata): risks and
benefits of high energy diets. Aquaculture 171, 279–292.
Duan, C., 1997:
The insulin-like growth factor system and its biological actions in fish.
American Zoology 37, 491–503.
Duan, C., 1998:
Nutritional and developmental regulation of insulin-like growth factors in
fish. Journal of Nutrition 128, 306S–314S.
Dyer, A. R.;
Upton, Z.; Stone, D.; Thomas, P. M.; Soole, K. L.; Higgs, N.; Quinn, K.;
Carragher, J. F., 2004: Development and validation of a radioimmunoassay for
fish insulin-like growth factor I (IGF-I) and the effect of aquaculture related
stressors on circulating IGF-I levels. General and Comparative Endocrinology
135, 268–275.
Englyst, H. N.;
Quigley, M. E.; Hudson, G. J., 1994: Determination of dietary fiber as
non-starch polysaccharides with gas–liquid chromatographic, high-performance liquid
chromatographic or spectrophotometric measurement of constituent sugars.
Analyst 119, 1497–1509.
Francis, G.; Makkar,
H. P. S.; Becker, K., 2001: Antinutritional factors present in plant derived
alternate Influences of Jatropha meal in common carp diet on GH and IGF-1 gene
expression V. Kumar et al. fish feed ingredients and their effects in fish.
Aquaculture 199, 197–227.
Gomes, E. F.;
Corraze, G.; Kaushik, S., 1993: Effects of dietary incorporation of a
co-extruded plant protein (rapeseed and peas) on growth, nutrient utilization and
muscle fatty acid composition of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).
Aquaculture 113, 339–353.
Go´ mez-Requeni,
P.; Mingarro, M.; Kirchner, S.; Calduch- Giner, J. A.; Me¢dale, F.; Corraze,
G.; Panserat, S.; Martin, S. A. M.; Houlihan, D. F.; Kaushik, S. J.; Pe´rez-Sa´nchez,
J., 2003: Effects of dietary amino acid profile on growth performance, key
metabolic enzymes and somatotropic axis responsiveness of gilthead sea bream
(Sparus aurata). Aquaculture 220, 749–767.
Go´ mez-Requeni,
P.; Mingarro, M.; Calduch-Giner, J. A.; Me´dale, F.; Martin, S. A. M.;
Houlihan, D. F.; Kaushik, S.; Pe´rez-Sa´nchez, J., 2004: Protein growth
performance, amino acid utilisation and somatotropic axis responsiveness to
fish meal replacement by plant protein sources in gilthead sea bream (Sparus
aurata). Aquaculture 223, 493–510.
Go´ mez-Requeni,
P.; Calduch-Giner, J.; Vega-Rubı´n de Celis, S.; Me´ dale, F.; Kaushik, S. J.;
Pe´rez-Sa´nchez, J., 2005: Regulation of the somatotropic axis by dietary factors
in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). British
Journal Nutrition 94, 353–361.
Hasan, M. R.;
Macintosh, D. J.; Jauncey, K., 1997: Evaluation of some plant ingredients as
dietary protein sources for common carp (Cyprinus carpio L.) fry. Aquaculture 151,
55–70.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar